上一期我們給大家講解了免疫熒光技術的樣品制備流程和注意事項，這一期我們一起來學習一下免疫熒光技術的實驗操作流程和技術細節。
下面，我們首先來看一下免疫熒光技術的操作流程：
免疫熒光技術流程
細胞間接免疫熒光-IF(ICC)
按合適的細胞密度接種細胞爬片
1.棄去細胞培養液，PBS洗3次，5 min/次。
2.固定：4%多聚甲醛室溫固定20 min，也可4℃固定過夜。
根據細胞室提供細胞的時間，若下午提供，那么當天不能完成實驗，所以會在固定這步暫停，即4℃固定過夜；若上午提供細胞，當天可以完成全部實驗，即室溫固定20min。平時多數實驗是室溫固定20min。
3.PBS洗3次，5 min/次。
4.透膜：用含有0.3% Triton X -100的 PBS室溫孵育20 min（如檢測細胞膜外側蛋白，可省略此步）。
5.PBS洗3次，5 min/次。
6.封閉：用PBS配制的5%~10%二抗來源相同種屬正常血清室溫封閉20 min。
7.PBS洗3次，3 min/次。
8.用Bioss標準抗體稀釋液按合適比例稀釋一抗，37℃下孵育2 h或4℃過夜（孵育抗體的濃度、孵育時間通過預實驗確定）。
9.PBST洗3次，10 min/次。
10.用Bioss標準熒光抗體稀釋液按合適比例稀釋二抗，37℃下孵育1h （孵育抗體的濃度、孵育時間通過預實驗確定） 。
11.PBST洗3次，10 min/次。
12.DAPI復染細胞核。
13.PBS洗3次，5 min/次。
14.取出細胞爬片置于載玻片上，鏡下觀察。
冷凍組織切片間接免疫熒光（IF-F）
1.制備好的冰凍切片放置于室溫復溫。
2.PBS洗3次，5 min/次。
3.封閉：用PBS配制的5%~10%二抗來源相同種屬正常血清室溫封閉20 min。
4.PBS洗3次，3 min/次。
5.用Bioss標準抗體稀釋液按合適比例稀釋一抗，37℃下孵育2 h或4℃過夜（孵育抗體的濃度、孵育時間通過預實驗確定）。
6.PBST洗3次，10 min/次。
7.用Bioss標準熒光抗體稀釋液按合適比例稀釋二抗，37℃下孵育1h （孵育抗體的濃度、孵育時間通過預實驗確定） 。
8.PBST洗3次，10 min/次。
9.DAPI復染細胞核。
10.PBS洗3次，5 min/次。
11.用防熒光淬滅封片劑封片，鏡下觀察。
石蠟包埋組織切片間接免疫熒光（ IF-P ）
1.制備好的石蠟切片按以下順序進行脫臘水化
二甲苯?：20min，二甲苯П：20min，二甲苯Ш：20min，無水乙醇：15min，95%乙醇：15min，70%乙醇：15min，50%乙醇：15min，蒸餾水?：5min，蒸餾水II：10min。
2.PBS洗3次，5 min/次。
3.抗原修復：0.01M枸櫞酸修復液（依據抗原種類不同選擇合適的抗原修復液與修復方式），沸水浴熱修復15min。
4.PBS洗3次，5 min/次。
5.封閉：用PBS配制的5%~10%二抗來源相同種屬正常血清室溫封閉20 min。
6.PBS洗3次，3 min/次。
7.用Bioss標準抗體稀釋液按合適比例稀釋一抗，37℃下孵育2 h或4℃過夜（孵育抗體的濃度、孵育時間通過預實驗確定）。
8.PBST洗3次，10 min/次。
9.用Bioss標準熒光抗體稀釋液按合適比例稀釋二抗，37℃下孵育1h （孵育抗體的濃度、孵育時間通過預實驗確定） 。
10.PBST洗3次，10 min/次。
11.DAPI復染細胞核。
12.PBS洗3次，5 min/次。
13.用防熒光淬滅封片劑封片，鏡下觀察。
直接免疫熒光
1. 4%多聚甲醛室溫固定樣品20 min，也可4℃固定過夜。
2.PBS洗3次，5 min/次。
3.封閉：用PBS配制的5%~10%二抗來源相同種屬正常血清室溫封閉20 min。
4.PBS洗3次，3 min/次。
5.用Bioss標準熒光抗體稀釋液按合適比例稀釋一抗，37℃下孵育2h或4℃過夜（孵育抗體的濃度、孵育時間通過預實驗確定）。
6.PBST洗3次，10 min/次。
7.DAPI復染細胞核。
8.PBS洗3次，5 min/次。
9.用防熒光淬滅封片劑封片，鏡下觀察。
1.通透
通透能夠使抗體與胞內抗原相結合，其中包括抗原表位位于胞內端的跨膜蛋白，使用溶劑或去垢劑可實現通透化。若采用丙酮或甲醇固定，則可跳過。
1.溶劑：可在用交聯劑（如多聚甲醛）固定后使用。推薦用于細胞骨架、病毒和某些酶抗原。
2.去垢劑：包括能夠破壞蛋白的作用劇烈的去垢劑（如 Triton X-100 或 Np-40）；也可以是不會溶解質膜的作用溫和的去垢劑（如 Tween 20、皂素或洋地黃皂苷）。
2.封閉
用血清或蛋白封閉劑進行封閉是避免抗體與組織（某些易結合蛋白的物質）或 Fc 受體（結合抗體恒定區 (Fc) 的受體）非特異性結合的必要手段。理論上，對靶標表位沒有親和性結合的任何蛋白都可用于封閉。但事實上，某些蛋白更容易與非特異性位點相結合，因此他們更適合用于封閉。血清中包含可與非特異位點結合的抗體，是一種常用的封閉劑。推薦使用與二抗相同宿主的血清。當使用來自不同物種的二抗進行多重染色時，需要使用這些物種的血清共同封閉。
自發熒光的封閉
自發熒光可由組織中存在的熒光化合物引起，例如黃素和卟啉。這些化合物會被用于固定、脫水切片的溶劑從組織中溶解，然而，其仍會存留在使用水性試劑處理的冰凍切片中；固定步驟也可能誘導自發熒光，在使用醛類固定劑時通常會發生這類情況，醛類固定劑會與胺類反應生成熒光產物。應進行檢測以確保待研究的組織沒有內在自發熒光或者固定步驟不會誘導自發熒光。
1.使用冰凍切片，降低固定過程中誘導自發熒光的可能性。
2.使用非醛類的固定劑。
3.用硼氫化鈉或甘氨酸/賴氨酸處理組織，以此封閉固定過程中帶來的醛基。
4.利用淬滅染料處理組織，例如滂胺天藍/蘇丹黑/臺盼藍或FITC封閉劑。
3.抗體染色
1. 一抗孵育溫度可以選擇4℃、室溫、37℃，其中4℃效果最佳（ 4℃和37℃時分子運動方式不同，前者分子碰撞機率和運動速度小于后者，后者結合更快，但敏感性也提高了并易造成非特異染色）。
2. 孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關，一般37℃ 下1~2h，4℃下孵育過夜，注意4℃孵育后需要復溫（防止切片從4℃直接放入PBS易脫片）。
3. 二抗一般室溫或37℃ 30min~2h，具體時間需要摸索。
檢測結果展示
